Comentarios:
a) La electroforesis en general permite la separación de moléculas como consecuencia de su diferente movilidad en un campo eléctrico. Por lo tanto,el parámetro esencial es la diferente carga eléctrica de las moléculas (matizado en la nota d). Es importante recordar que la carga depende del pH del medio. En determinados soportes, como el gel de agarosa mostrado aquí, el medio (gel) ofrece una resistencia notable al avance de las moléculas, por lo cual la movilidad depende mucho del tamaño de la molécula (véase nota d).
b) Las moléculas de DNA y RNA son en general demasiado grandes para que avancen a una velocidad razonable por estos geles, por lo que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a electroforesis.
c) La agarosa
es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,
pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones
(típicamente de 0,5 a 2%) poseen la propiedad de permanecer
líquidas por encima de aprox. 50ºC y formar un gel,
semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido por una
matriz
o trama tridimensional de fibras polimericas, embebida en gran cantidad
de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de
ácido nucleico a su través, en mayor medida cuanto más
grandes sean éstas.
Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se dejan
en él unos huecos o pocillos
para poder introducir luego en ellos la muestra, y que así ésta
se vea obligada a introducirse en el seno del gel cuando apliquemos el
campo eléctrico (visto de perfil:
)d) Dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, el parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) es realmente la relación carga/masa. Para un ácido nucleico, la carga eléctrica es proporcional a la longitud en nucleótidos, por lo que la relación q/m es la misma para todas las moléculas. Sin embargo, el efecto de retardo debido al gel depende del tamaño molecular. Como resultado neto, la electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en nucleótidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, caso común del DNA). Es, por ello, posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamaño frente a 1/movilidad (como en la figura) o log(tamaño) frente a movilidad.
